当期目录

2012年 第32卷 第2期    刊出日期：2012-02-05

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干细胞专题

间充质干细胞分化潜力与免疫调节的研究

韩钦

2012, 32(2):  113-113. 

摘要 ( 1252 )   PDF (120KB) ( 798 )  

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miR-424负向调节人脂肪源间充质干细胞向成脂细胞的分化

黄姗 王世华 韩钦 赵春华

2012, 32(2):  114-118. 

摘要 ( 1558 )   PDF (1256KB) ( 831 )  

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目的 研究miR-424对人脂肪源间充质干细胞（hAMSCs）向成脂分化的影响。方法 用real-time PCR检测hAMSCs成脂分化前后细胞内miR-424水平的变化。在脂质体介导下，用人工合成的miR-424模拟物转染hAMSCs提高细胞内miR-424的含量，随后对其进行成脂诱导。用油红O染色法观察细胞内脂滴形成情况，用Real-Time PCR和Western blot检测成脂关键转录因子PPARγ及相关标记物mRNA的表达。结果 hAMSCs成脂分化后，miR-424表达下调。与对照组细胞相比，转染miR-424模拟物的实验组细胞中miR-424含量明显升高。成脂诱导第8天油红O染色结果显示，实验组脂滴形成显著少于对照组。PPARγ和成脂相关标记物的表达量也出现下调。结论 miR-424可负向调节hAMSCs向脂肪细胞分化。

microRNA-373参与调控人脂肪来源间充质干细胞成骨分化

曾洋 林瑞竹 赵春华

2012, 32(2):  119-122. 

摘要 ( 1751 )   PDF (932KB) ( 1065 )  

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目的 用microRNA-373（miR-373）的模拟物转染人脂肪来源Flk1+间充质干细胞（MSC），探讨microRNA-373对Flk1+MSC成骨分化的影响。方法 利用脂质体作为载体，用miR-373模拟物瞬时转染Flk1+MSCs，然后对其进行成骨诱导，碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色观察成骨情况， Real-time PCR技术检测成骨标志性基因的表达。结果 ALP染色和茜素红可见明显差异；real-time PCR检测结果显示，实验组（miR-373组）成骨标志基因runt相关转录因子2（RUNX2）（0.543±0.021）、ALP（0.556±0.024）和骨钙蛋白（OC）（0.499±0.017）的表达都明显低于对照组（NC组）（p＜0.05）。结论 miR-373参与调控Flk1+MSC向骨细胞分化。

体外诱导脂肪来源间充质干细胞间质-上皮转换

杨倩 张丽娜 李康华 赵春华

2012, 32(2):  123-127. 

摘要 ( 1382 )   PDF (828KB) ( 742 )  

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目的 探讨在体外诱导人脂肪来源间充质干细胞(hAD-MSCs)发生间质-上皮转换(MET)的可行性。 方法 从人脂肪中分离、培养间充质干细胞，流式细胞术鉴定其细胞表面标志。在体外添加激活素A(activin A)、维甲酸(RA)和骨形态发生蛋白7(BMP7)培养后，倒置显微镜下观察hAD-MSCs诱导后的形态变化，采用RT-PCR方法检测间质和上皮细胞相关基因vimentin，E-cadherin，ZO-1和β-catenin在诱导分化过程中表达水平改变。Western blot检测诱导前后间质标记vimentin和上皮标记β-catenin的表达。 结果 诱导后细胞形态发生改变，由长梭形变为卵圆形，上皮标记基因E-cadherin，ZO-1和β-catenin的mRNA表达显著上调（P<0.05），同时间质标志基因vimentin的mRNA表达显著下降（P<0.05）。Western blot结果显示，与未诱导组相比，诱导后细胞开始表达β-catenin，而vimentin的表达明显下降（P<0.05）。结论 Activin A、RA和BMP7联合使用可诱导hAD-MSCs发生MET的过程。

骨髓和脂肪来源的间充质干细胞免疫调节作用的比较

孙昭 韩钦 赵春华

2012, 32(2):  128-132. 

摘要 ( 1878 )   PDF (697KB) ( 831 )  

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目的 比较脂肪源间充质干细胞（AMSCs）和骨髓来源间充质干细胞（BMSCs）的免疫调节能力的差异。方法 用流式细胞仪分析AMSCs和BMSCs的表型。通过MSCs和淋巴细胞共培养体系，检测MSCs对T细胞增殖、周期、活化、凋亡以及Th细胞分化的影响。结果 表型分析结果显示AMSCs和BMSCs的表型基本一致。AMSCs和BMSCs都能抑制T细胞的增殖和早期活化，并在调节辅助性T细胞亚群的分化上作用类似。但在MSC对活化后T细胞的凋亡影响方面，BMSCs能够抑制活化T细胞的凋亡，而AMSC没有这种作用。结论 AMSCs和BMSCs对T淋巴细胞的影响基本类似，其对活化T细胞凋亡影响的差异还有待进一步的机制研究。

骨髓Sca-1+间充质干细胞移植减轻小鼠迟发型超敏反应

曲学彬 刘星霞 赵春华

2012, 32(2):  133-137. 

摘要 ( 1570 )   PDF (844KB) ( 777 )  

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目的 探讨骨髓Sca-1+间充质干细胞（BM-MSCs）在迟发型超敏反应（DTH）小鼠中的免疫调控作用。方法 小鼠随机分为对照组及MSCs注射组。注射组于0、2及6 d腹腔注射Balb/c小鼠Sca-1+ BM-MSCs，对照组注射生理盐水。所有鼠在7和14 d时分别于背部皮下与足跖注射C57BL/6小鼠脾细胞。24 h后用千分尺测量小鼠足跖的肿胀，ELISA法测外周血细胞因子及FACS法测脾脏免疫细胞比例。结果 注射组小鼠足跖的肿胀程度（0.368 ? 0.126 mm）显著轻于对照组（0.731 ? 0.111 mm，p < 0.01）。注射组外周血中IL-10和TGF-β含量显著高于对照组（p < 0.05）；而IL-12和TNF-α水平显著低于对照组（p < 0.05）。注射组小鼠脾脏调节型T细胞、树突细胞的比例明显高于对照组。结论 BM-MSC通过上调抑炎因子和调节型免疫细胞的数量而减轻DTH小鼠的免疫反应。

研究论文

Slug对照射鼠肠上皮细胞的保护作用及机制

迟绍云

2012, 32(2):  138-142. 

摘要 ( 1399 )   PDF (917KB) ( 631 )  

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目的：研究Slug过表达对照射鼠肠上皮细胞的保护作用及机制 方法：以体外培养的小肠隐窝上皮细胞IEC6和转染了Slug cDNA的IEC6为研究对象，对细胞进行6Gy剂量γ射线照射，在照射48h后观察细胞凋亡指数，免疫组化和Western blot法检测PUMA蛋白表达。结果：6Gy射线照射IEC6细胞48h后的细胞凋亡指数为15.6+1.54，明显高于照射联合pcDNA3-Slug cDNA转染组的5.1+1.7（P<0.01）和单独pcDNA3-Slug cDNA转染组的2.21+0.36（P<0.01）。Weatern blot法检测发现，6Gy射线照射IEC6细胞48h后的PUMA相对表达为0.79+0.12，明显高于照射联合pcDNA3-Slug cDNA转染组的0.16+0.01（P<0.01），免疫组化和Weatern blot法检测结果一致。结论：上调Slug抑制射线诱导的细胞PUMA表达上调，抑制IEC6细胞凋亡。

转化生长因子β1对乳鼠心肌细胞转化生长因子结合蛋白2表达的影响

白媛媛 魏英杰 崔传珏 李君 刘晓艳 史强

2012, 32(2):  143-148. 

摘要 ( 1226 )   PDF (1437KB) ( 673 )  

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目的：探讨转化生长因子β1（TGF-β1）在诱导心肌细胞表达转化生长因子结合蛋白2（LTBP2）中的作用及信号传导通路。 方法：培养乳鼠心肌细胞；实时定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）、蛋白质印迹和免疫细胞化学方法检测不同时间和不同浓度的TGF-β1对大鼠乳鼠心肌细胞LTBP2基因及蛋白表达的影响；用TGF-β1相关信号通路阻断剂探讨TGF-β1调节LTBP2表达改变的信号传导机制。 结果：LTBP2基因表达随着TGF-β1浓度增加（0、2、5、10 ng/mL）而明显升高，在5 ng/mL时刺激最强（P < 0.05）；5 ng/mL的TGF-β1刺激下心肌细胞内LTBP2基因和蛋白表达的升高呈时间依赖性，均在12 h最高，24 h开始呈下降趋势（P < 0.05或P<0.01）；免疫细胞化学结果显示TGF-β1明显升高LTBP2的表达。信号传导通路研究显示TGF-β1在心肌细胞内主要通过ERK信号通路和PI3K信号通路诱导LTBP2的表达。 结论：TGF-β1在乳鼠心肌细胞内通过ERK信号通路和PI3K信号通路上调LTBP2的表达。

用慢病毒载体介导的RNAi感染CB3细胞后抑制FLI-1的表达

李岩 宋伟 李薇 王雪梅 王冠军 崔久嵬

2012, 32(2):  149-153. 

摘要 ( 1389 )   PDF (1255KB) ( 764 )  

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【摘要】目的 观察慢病毒载体介导的RNA干扰(RNA interference, RNAi)方法对小鼠红白血病细胞（CB3）中FLI-1（Friend leukemia integration-1,FLI-1）基因表达的抑制作用，以为后续实验提供有力的技术支持。方法 设计制备针对目的基因FLI-1的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA),构建制备目的基因的siRNA慢病毒载体，PCR阳性菌落进行测序鉴定，对慢病毒包装与滴度测定后感染CB3细胞,观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表达情况。RT-PCR和Western blot检测病毒感染CB3细胞后FLI-1的表达。结果 成功构建了针对FLI-1基因的siRNA慢病毒载体,并包装成慢病毒颗粒，病毒滴度为1.5E+9TU/ml，并可将其高效感染CB3细胞，病毒感染后FLI-1在转录水平和翻译水平的表达量显著低于对照组和未感染病毒组（P<0.001）。结论 成功构建了针对FLI-1基因的siRNA慢病毒载体，并可有效抑制CB3细胞中FLI-1基因的表达,为后续实验提供稳定的感染细胞载体。

43例中国眼部恶性黑色素瘤cKit和BRAF基因突变分析

孔燕 梁龙 斯璐 代杰 俎明 张虔男 郭军

2012, 32(2):  154-157. 

摘要 ( 2704 )   PDF (658KB) ( 660 )  

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目的 分析中国眼部恶性黑色素瘤中cKit和BRAF基因突变情况。方法 收集43例中国眼部恶性黑色素瘤患者组织标本（脉络膜恶性黑色素瘤30例，结膜恶性黑色素瘤13例）, 采用巢式PCR扩增和基因测序的方法检测cKit基因第9,11,13,17,18外显子以及BRAF基因第15外显子突变情况。结果cKit基因在脉络膜恶性黑色素瘤患者中突变率达16.7%(5/30)，而在结膜恶性黑色素瘤中突变率仅为7.7% (1/13)；在结膜恶性黑色素瘤中检测到1例BRAF基因突变(1/13)，在脉络膜恶性黑色素瘤中未检测到BRAF基因突变。结论 本研究首次报道cKit基因在中国脉络膜恶性黑色素瘤患者中突变率较高，提示以cKit为靶标的靶向药物未来有可能为中国眼部恶性黑色素瘤患者，尤其是脉络膜恶性黑色素瘤患者带来新的希望。

电针对局灶脑缺血再灌注大鼠大脑皮质eNOS mRNA及蛋白、MMP-9蛋白表达的影响

卢桃利 罗勇

2012, 32(2):  158-163. 

摘要 ( 1444 )   PDF (1096KB) ( 680 )  

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摘要:目的 探讨电针对局灶脑缺血/再灌注大鼠脑内缺血皮质区eNOS mRNA及蛋白、MMP-9蛋白表达的影响。方法 采用线栓法制备SD大鼠局灶脑缺血/再灌注模型。将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组。缺血2h后把模型组和电针组分为再灌注1、3和7d 3个时间点。取双侧“合谷”穴（LI 4）为电针刺激穴位。免疫组化法检测eNOS蛋白的表达；逆转录聚合酶链法检测eNOS mRNA的表达；Western blot法检测eNOS 、MMP-9蛋白的表达。结果 与假手术组比较，模型组、电针组各时间点大鼠缺血大脑皮质区eNOS蛋白及mRNA表达增加显著（P<0.01）；与模型组比较，电针组各时间点eNOS 蛋白及mRNA增加明显（P<0.01）。eNOS蛋白表达于再灌注3d达高峰，假手术组表达为 (0.4291±0.0173)，模型组再灌注3d表达为 (0.7374±0.0252)，电针组表达为 (0.8536±0.0212)，各组比较差异显著（P<0.01）。与假手术组比较，模型组、电针组各时间点大鼠缺血大脑皮质区MMP-9蛋白的表达增加显著（P<0.01）；与模型组比较，电针组MMP-9蛋白的表达于再灌注1d低于模型组（P<0.01），再灌注3、7 d电针组MMP-9蛋白的表达明显高于模型组（P<0.01）。 结论 电针可上调局灶脑缺血/再灌注大鼠缺血皮质区eNOS蛋白及mRNA、MMP-9蛋白的表达。

低氧对食管癌Eca109细胞体外迁移及侵袭的影响

景绍武 王雅棣 孙国贵 刘青 程云杰 吴凤鹏

2012, 32(2):  164-169. 

摘要 ( 1550 )   PDF (1446KB) ( 883 )  

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目的 探讨低氧对食管癌迁移及侵袭能力的影响及其作用机制。方法 采用CoCl2化学低氧法模拟肿瘤低氧微环境，半定量RT-PCR和免疫细胞化学分别检测不同低氧时相时食管癌Eca109细胞中低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、E-钙粘蛋白及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）mRNA及蛋白的表达。Western印迹法检测雷帕霉素联合低氧处理Eca109细胞后，HIF-1α、E-钙粘蛋白及MMP-2的变化。细胞划痕试验和Transwell实验检测雷帕霉素联合低氧对Eca109细胞迁移及侵袭能力的影响。结果 Eca109细胞在低氧状态下，HIF-1αmRNA无明显变化（P>0.05），仅蛋白表达增多；E-钙粘蛋白的mRNA表达明显降低（P<0.05），蛋白表达减少；MMP-2 mRNA表达明显升高（P<0.05），蛋白表达增多。雷帕霉素在低氧状态下可显著抑制HIF-1α及MMP-2表达，促进E-钙粘蛋白高表达。经雷帕霉素处理后，Eca109细胞在低氧状态下，迁移速度减慢，侵袭穿膜细胞数减少（P<0.05）。结论 低氧使Eca109细胞中HIF-1α蛋白表达增多，后者可能通过下调E-钙粘蛋白、上调MMP-2表达促进食管癌在低氧状态下的迁移及侵袭。

三七总皂甙降低兔肺缺血再灌注损伤和抑制细胞凋亡

倪世容 徐正衸 王鑫

2012, 32(2):  170-174. 

摘要 ( 1441 )   PDF (1217KB) ( 965 )  

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目的: 探讨细胞凋亡与肺缺血再灌注损伤的关系以及三七总皂甙的作用及机制。方法: 健康日本大耳白兔84只,随机分为对照组、肺缺血再灌注1、3、5h组和相应三七总皂甙干预组。复制肺缺血再灌注损伤模型。用原位缺口末端标记(TUNEL)法、聚丙烯酰胺凝胶电泳观测肺组织细胞凋亡,原位杂交技术检测肺组织细胞Fas/FasL系统和Caspase-3基因表达。结果: 肺缺血再灌注组肺组织细胞凋亡指数(肺缺血再灌注5h组:22.08±1.93；对照组:2.04±0.67)、Fas/FasL和Caspase-3基因表达(肺缺血再灌注5h组:0.241±0.029；对照组:0.121±0.015)均显著高于对照组(P<0.01),并出现电泳梯形条带结构;三七总皂甙干预组Fas/FasL mRNA及其Caspase-3的表达(三七总皂甙干预5h组:0.199±0.020；肺缺血再灌注5h组:0.241±0.029)显著低于缺血再灌注组(P<0.01),肺组织细胞凋亡指数(三七总皂甙干预5h组:12.58±1.82；肺缺血再灌注5h组:22.08±1.93)也显著低于缺血再灌注组(P<0.01),梯形条带结构基本消失。肺组织细胞凋亡指数分别与Caspase-3 mRNA及Fas/FasL mRNA之间均呈显著正相关(P<0.01)。结论:三七总皂甙可能通过抑制Fas/FasL系统的激活,阻遏肺组织细胞凋亡,从而减轻肺缺血再灌注损伤。

阻断PLCε基因与膀胱癌细胞侵袭性相关机制研究

欧俐苹 罗春丽

2012, 32(2):  175-180. 

摘要 ( 1582 )   PDF (1540KB) ( 642 )  

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目的　构建PLCε基因的shRNA表达载体转染膀胱癌细胞T24株，观察其对T24细胞转移侵袭等恶性行为的影响。方法 设计并合成针对PLCε基因mRNA的寡核苷酸序列，插入绿色荧光蛋白质粒真核表达载体pGenesil中，构建重组载体pGenesil-PLCε。重组载体转染T24细胞后，RT-PCR、Western blot检测对T24细胞PLCε表达的作用；以侵袭小室、明胶酶谱分析及免疫组化检测其对T24细胞侵袭能力变化。结果　成功构建了针对PLCε基因的shRNA表达载体。RT-PCR检测显示,2个阳性重组质粒转染膀胱癌细胞T24，对其PLCεmRNA表达抑制率分别为76.0%,73.9%，Western blot检测显示：对PLCε蛋白表达抑制率分别为65.4%，64.8%。对T24细胞的侵袭转移能力, 阳性质粒P1和P2转染组穿膜细胞数分别为(25.8±6.2) 和P2转染组(26.8±5.8)，明显少于空白对照组(34.8±6.9)(P＜0.01)和阴性质粒HK-A转染组(33.8±5.7)(P＜0.01)；明胶酶谱及免疫细胞化学显示转染P1、P2均使细胞分泌MMP-2、MMP-9明显低于空白对照和HK-A转染组(p<0.01)。结论 通过阻断PLCε基因，能有效抑制膀胱癌T24细胞株中PLCε基因和其蛋白表达，并且对T24细胞的侵袭转移能力具有一定的抑制作用。

CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞抑制肺结核患者特异细胞免疫

胡良安

2012, 32(2):  181-185. 

摘要 ( 1288 )   PDF (538KB) ( 599 )  

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目的 了解结核患者外周血中CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞在抑制结核患者结核特异细胞免疫反应中的作用。 方法 使用细胞分离、流式细胞分析、细胞增殖和细胞因子测定等方法，比较结核患者及健康正常人群外周血中CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞的量及功能特征的差异。 结果 结核患者外周血中CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞数占CD4+细胞总数的比例显著高于健康正常人群；在BCG及ESAT-6的刺激下，结核患者外周血单个核细胞增殖能力和产生γ-干扰素的能力比健康正常人群明显增强。在BCG刺激下，结核患者外周血CD4-细胞产生γ-干扰素(1289.62±519.01)及白介素-10(1045.40±534.12)的能力比结核患者外周血BPMCs细胞产生γ-干扰素(624.50±261.13)及白介素-10(377.00±249.56)的能力显著增强(均p<0.05)；在BCG及ESAT-6的刺激下，结核患者外周血CD4+CD25+调节T细胞显著抑制结核患者外周血CD4+CD25-细胞产生γ-干扰素及白介素-10。 结论 结核患者CD4+CD25+FoxP3+调节T细胞数量增多，抑制结核患者结核特异细胞免疫反应功能增强，可能与结核的发生、发展及转归有密切关系。

9-顺式维甲酸对甲状腺鳞癌细胞周期及CyclinD1、CDK4表达的影响

张秀梅 肖建英 刘超

2012, 32(2):  186-190. 

摘要 ( 1486 )   PDF (989KB) ( 687 )  

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摘 要：目的 探讨9-顺式维甲酸（9-cisRA）对甲状腺鳞癌细胞株SW579细胞周期及周期因子表达的影响。方法以终浓度分别为为10-7 mol/L、10-6 mol/L、5×10-6 mol/L、10-5 mol/L 的9-cisRA处理SW579细胞株，采用MTT比色法测定细胞增殖活性；流式细胞仪检测细胞周期；用RT-PCR方法检测SW579细胞CDK4、CyclinD1mRNA的表达水平；用Western blotting检测SW579细胞CDK4、CyclinD1的蛋白表达。结果 9-cisRA作用后，MTT结果显示，各组细胞均出现显著的生长抑制作用，生长抑制率明显升高，并呈剂量依赖性。流式细胞仪分析，各组细胞均随着药物浓度的升高，S期细胞在细胞周期中所占比例逐渐减少，G1期细胞则明显增加（P<0.01）,细胞滞留在G1期。RT-PCR检测结果表明，经不同浓度9-cisRA处理的细胞CDK4 mRNA表达水平没有明显变化；CyclinD1的表达水平明显下调；Western blotting检测结果表明经不同浓度9-cisRA处理的细胞CDK4蛋白表达水平没有明显变化，CyclinD1蛋白表达水平明显下降。结论9-cisRA对SW579细胞有显著的生长抑制作用，可能与抑制CyclinD1的表达，从而将细胞阻滞于G1期有关。

宫颈癌血清相关蛋白的初步探讨及鉴定

杨佳欣 郎景和 沈铿 曹冬焱 荣春红

2012, 32(2):  191-194. 

摘要 ( 126 )   PDF (542KB) ( 452 )  

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[摘要] 目的：寻找宫颈癌患者和对照组之间血清的蛋白差异，分离纯化差异蛋白，并以质谱技术进行鉴定。方法：SELDI-TOF-MS分析宫颈癌患者和对照组血清蛋白表达得到差异蛋白/肽，离子交换层析、SDS-PAGE进一步分离纯化差异蛋白，SELDI-TOF-MS在分离纯化过程中验证差异蛋白的存在，最后ESI-LC-MS/MS对差异蛋白进行质谱鉴定。结果：宫颈癌患者和对照组血清之间差异蛋白（ P<0.05）12个，对其中M/Z 15960Da的差异蛋白进行分离纯化鉴定，比对数据库鉴定出8类蛋白，与15960Da分子量最接近的是甲状腺激素转运蛋白( TTR)，有少数研究表明它的某些修饰形式与肿瘤有关。从蛋白的生物学行为上最有意义的是转录中介因子TIF1-β，也叫做KAP-1/KRAB/TRIM28，它的表达可能引起肿瘤相关基因的失活或活化，导致肿瘤发生发展。结论：我们在国内首次采用SELDI-TOF-MS寻找差异蛋白并辅助蛋白分离纯化，LC-ESI-MS/MS鉴定蛋白的技术路线。对M/Z15960Da的差异蛋白分离纯化鉴定，数据库匹配出8类可能的蛋白，TTR的分子量最接近，而TIF1-β生物学行为意义更重要。

海马NDMA受体与胃肌间神经丛NOS神经元分布在慢性应激性胃运动变化中的关系

乔卉 何娟 饶志萍 徐畅 安书成

2012, 32(2):  195-200. 

摘要 ( 1454 )   PDF (813KB) ( 682 )  

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目的 探讨慢性应激对大鼠胃功能和胃肠神经系统的影响，并分析其海马谷氨酸（Glu）离子型受体机制。方法 通过建造慢性应激性抑郁模型大鼠，结合脑立体定位及微量注射Glu和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体阻断剂MK-801，对实验鼠进行糖水偏爱等行为学检测、胃内压记录及胃内在神经丛的一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)阳性神经元表达的组织化学检测。结果 慢性不可预见性温和应激（CUMS）动物表现出抑郁样行为，且胃运动减弱；海马注射NMDA受体阻断剂MK-801，可以反转CUMS的效应；海马注射Glu，能增加游泳不动时间，但对胃运动无影响。CUMS使胃肌间神经丛NOS阳性神经元数量减少（73.74±16.38/LPF，P<0.05），神经节数量减少（4.25±1.34/LPF， P<0.05），但每个神经节内神经元数量明显增加（6.55±2.37，P<0.05）；海马注射MK-801，能改善CUMS引起的神经节数量减少的现象。结论 慢性应激诱发的抑郁样行为与海马Glu 及其NMDA受体有关，而胃活动的减弱可能与海马NMDA受体变化影响胃肌间神经丛NOS神经元分布格局有关

遗传性弥漫型胃癌家系上皮型钙黏素基因的分析

李小毅 周春宇 陈原稼 钟定荣 刘洪沨 高维生

2012, 32(2):  201-206. 

摘要 ( 1457 )   PDF (1857KB) ( 697 )  

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摘要：目的 研究在遗传性弥漫型胃癌家系中是否存在上皮型钙黏素基因(CDH1)以及基因表达的异常。 方法 收集符合遗传性弥漫型胃癌(HDGC)诊断标准的1个家系中15例成员的外周血和组织标本。通过免疫组化和Western blot 的方法检测组织标本CDH1蛋白表达; 提取基因组DNA, 通过PCR扩增DNA直接测序检测CDH1基因16个外显子突变。用克隆测序法，鉴定CDH1基因启动子区CpG位点甲基化状况。 结果 先证者和另一胃癌患者(家系2号成员)的癌旁胃粘膜上皮细胞CDH1蛋白表达较正常胃粘膜减弱, 两者肿瘤组织的蛋白表达几乎为阴性。包括先证者在内的11例家系成员第14外显子mRNA水平2377位点存在一个C?T的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP), 但未检测到16个外显子的胚系突变。相对于正常胃粘膜, 先证者和家系2号成员的胃癌组织均有CDH1基因启动子的高甲基化, 其瘤旁粘膜也有高甲基化。结论 此HDGC家系中,CDH1基因表达丢失可能和胃癌发生有关, CDH1基因外显子突变不是其肿瘤组织上皮型钙黏素蛋白表达丢失的直接原因, 基因启动子区的甲基化可能是导致其失活的原因之一。

脓毒症患者血浆sCD14的动态变化及其临床意义

吴彩军 李春盛 黄逸

2012, 32(2):  207-210. 

摘要 ( 1236 )   PDF (410KB) ( 575 )  

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目的 研究脓毒症患者血浆可溶性白细胞分化抗原14（sCD14）的动态变化及其临床意义。 方法 选择北京朝阳医院急诊重症监护病房2009年8月～2010年3月脓毒症患者60例，另选20名健康正常人为对照组。脓毒症组根据多脏器功能不全综合征（MODS）临床诊断标准分为MODS（33例）和非MODS（27例）两个亚组。脓毒症组在明确诊断后第1、3、7天检测血浆sCD14的水平并且计算患者当天的APACHEⅡ评分。 结果 与正常对照组相比，脓毒症组血sCD14浓度显著升高（P<0.01）； MODS组血sCD14浓度（5.3±2.4）μg/mL 与非MODS组sCD14浓度（3.8±2.8）μg/mL比较明显升高（P<0.05）；MODS组APACHEⅡ评分较非MODS组升高（P<0.05）； 血sCD14浓度与APACHEⅡ评分具有正相关（P<0.05）。结论 脓毒症患者血浆中sCD14升高，sCD14浓度较高的患者APACHEⅡ评分较高，病情危重。

外源EGFP表达对肿瘤细胞体外生物学行为的影响

张敏 刘玉琴 赵文晶 李占稳 冯海凉 刘艳艳

2012, 32(2):  211-216. 

摘要 ( 1543 )   PDF (1401KB) ( 640 )  

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摘要：目的 探讨常用的可视化细胞标记技术--外源EGFP表达对肿瘤细胞生物学行为的影响。 方法 选择不同的携带EGFP的载体，利用脂质体转染或慢病毒感染技术，在不同肿瘤细胞系中强制表达外源EGFP，筛选稳定表达外源EGFP的细胞系，MTT法检测细胞体外增殖能力；细胞分析计数仪（CasyTT型）检测细胞大小的分布状况； Transwell体外迁移实验检测细胞体外侵袭能力。结果 成功建立了稳定表达外源EGFP的人结肠癌细胞系HCT116-GFP、HCT116-EGFP、COLO 320DM-EGFP和小鼠树突状细胞肉瘤细胞系DG6-EGFP。 外源EGFP表达后，HCT116-GFP细胞的增殖能力没有明显改变；而HCT116-EGFP细胞、COLO320DM-EGFP细胞和DG6-EGFP细胞的体外增殖能力明显降低。外源EGFP表达后，HCT116-EGFP细胞体积增大：平均直径分别为14.53 μm（HCT116）和18.28 μm（HCT116-EGFP）；DG6-EGFP细胞体积无明显改变，平均直径分别为：16.43 μm（DG6）和16.58 μm（DG6-EGFP）。外源EGFP表达后，HCT116-EGFP细胞的体外侵袭能力明显降低，DG6-EGFP细胞体外侵袭能力无明显改变。结论 外源EGFP可视化标记细胞后，可能会影响肿瘤细胞的生物特性，利用这些模型进行科研时，需注意对相关指标的影响。

RNA干扰沉默Bax基因对线粒体途径软骨细胞凋亡的影响

李宇

2012, 32(2):  217-221. 

摘要 ( 1844 )   PDF (927KB) ( 587 )  

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【摘要】 目的 利用体外培养的鼠软骨细胞，研究RNA干扰沉默Bax基因表达对经线粒体途径细胞凋亡的影响。方法 体外分离培养SD大鼠软骨细胞；Bax siRNA干扰沉默Bax基因表达。RT-PCR和Western blot检测mRNA及蛋白表达水平；MTT法检测细胞活力；Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡率；Western blot检测Bcl-2、Cytochrome C蛋白的表达。结果 Bax siRNA干扰24h后，Bax的mRNA和蛋白的表达水平均明显降低。细胞凋亡受到明显抑制，细胞存活率增高。并且，在Bax基因沉默的细胞中，Cytochrome C蛋白表达水平降低，同时Bcl-2蛋白表达水平升高。结论 RNA干扰沉默Bax基因可抑制鼠软骨细胞凋亡并且促进其存活，其机制可能与线粒体途径相关。

既往肝外恶性肿瘤病史患者的肝脏移植

李磊

2012, 32(2):  222-225. 

摘要 ( 1398 )   PDF (633KB) ( 661 )  

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目的 探讨既往有肝外恶性肿瘤病史患者的肝移植手术适应症和疗效。方法 2例术前分别因直肠癌和乳腺癌接受过根治性外科手术的患者，因肝癌或肝硬化接受同种异体原位肝移植术，术后采用个体化免疫抑制治疗方案，并对肝癌患者行术后常规化疗。 结果 2例患者术后恢复顺利，分别随访79个月年及34个月，肝功能良好，既往肝外肿瘤均未见复发。 结论 对既往有肝外恶性肿瘤的患者，肝移植手术并非禁忌，挑选合适的受者并采取个体化免疫抑制和化疗方案，可以取得满意疗效。

技术与方法

利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术在悬浮细胞中获得基因沉默效应

王淳

2012, 32(2):  226-232. 

摘要 ( 1417 )   PDF (1565KB) ( 736 )  

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摘要： 目的 利用重组腺病毒载体携带短发夹RNA （short hairpin RNA，shRNA），使难于转染的悬浮细胞达到较高的目的基因沉默效率。方法 将含有人胎盘生长因子（placental growth factor，PLGF）干扰序列的76 nt的寡核苷酸序列连入含有绿色荧光蛋白基因（GFP）的腺病毒穿梭质粒pRNAT-H1.1/Adeno中，获得重组穿梭质粒。重组穿梭质粒经限制性内切酶PmeⅠ线性化、去磷酸化回收后与腺病毒骨架pAdeasy-1共电转入BJ5183感受态细胞。同源重组后经限制性内切酶PacⅠ酶切鉴定，挑选阳性克隆并大量获得重组质粒。PacⅠ酶切质粒后转染HEK 293细胞，经过三轮病毒包装，收获病毒颗粒，经OD260方法和TCID50方法测定病毒滴度。病毒颗粒感染悬浮细胞——人小细胞肺癌细胞（NCI-H 250和NCI-H 209），通过实时定量PCR方法鉴定靶基因沉默效应，并利用肿瘤细胞重建基质膜侵袭实验进行功能鉴定。结果 NCI-H 250和NCI-H 209细胞在感染腺病毒颗粒48 h后，大部分细胞表达GFP，感染率接近100%；两株细胞感染腺病毒48 h后，PLGF mRNA表达水平明显下降，且靶基因沉默的肿瘤细胞侵袭能力明显下降。结论 携带shRNA的腺病毒表达载体，可以代替电转、脂质体介导等方法，使难于转染细胞的目的基因达到有效沉默。

短篇综述

四环素基因调控系统的研究进展

宫秀群 马敏敏 徐格林

2012, 32(2):  233-236. 

摘要 ( 1690 )   PDF (686KB) ( 1302 )  

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大量临床前研究均证实了病毒作为治疗基因载体的有效性和可行性。但将病毒载体技术用于临床疾病的治疗还面临一些挑战。其中，如何对病毒携带基因的表达实施定时定量调控是必需解决的一个关键问题。目前常采用的方法是在病毒载体基因组中构建调控系统中，而四环素基因调控系统（Tet系统）是迄今为止基因治疗研究中使用最广泛的系统。该系统通过改变培养基、体内四环素或其衍生物（如强力霉素）的浓度，诱导或抑制目标基因的表达。本文简要综述了Tet系统的研究进程及其在不同疾病中的应用。

前列腺癌近距离治疗后勃起功能障碍的研究进展

陈健

2012, 32(2):  237-240. 

摘要 ( 867 )   PDF (340KB) ( 650 )  

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